Notch-1基因敲除兔骨髓间充质干细胞可阻止椎间盘退行性变吗？

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.36.004

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (36): 6403-6408.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.36.004

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Notch-1基因敲除兔骨髓间充质干细胞可阻止椎间盘退行性变吗？

莫日格乐，邵增务

华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科，湖北省武汉市 430022

收稿日期:2012-12-09 修回日期:2012-12-31 出版日期:2013-09-03 发布日期:2013-09-03
通讯作者: 邵增务，主任医师，教授，博士生导师，华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科，湖北省武汉市 430022 zengwushao1962@hotmail.com
作者简介:莫日格乐☆，男，1979年生，内蒙古自治区呼和浩特市人，蒙古族，在读博士，主要从事骨与关节疾病研究。 morigele@hotmail.com

Restraining degeneration of intervertebral discs by transplantation of Notch-1knockout rabbit bone marrow mesenchymal stem cells

Mori Gele, Shao Zeng-wu

Department of Orthopedics, Union Hospital of Tongji Medical College of Huazhong University of Science & Technology, Wuhan 430022, Hubei Province, China

Received:2012-12-09 Revised:2012-12-31 Online:2013-09-03 Published:2013-09-03
Contact: Shao Zeng-wu, Chief physician, Professor, Doctoral supervisor, Department of Orthopedics, Union Hospital of Tongji Medical College of Huazhong University of Science & Technology, Wuhan 430022, Hubei Province, China zengwushao1962@hotmail.com
About author:Mori Gele☆, Studying for doctorate, Department of Orthopedics, Union Hospital of Tongji Medical College of Huazhong University of Science & Technology, Wuhan 430022, Hubei Province, China morigele@hotmail.com

摘要/Abstract

摘要：

背景：前期实验证明退变椎间盘内Notch-1基因高表达，但骨髓间充质干细胞向髓核样细胞转化时Notch-1的作用尚不明确。
目的：观测Notch-1基因敲除后的骨髓间充质干细胞修复退变椎间盘的作用。
方法：①4只体质量0.4-0.5 kg新西兰兔麻醉后，取股骨骨髓，以密度梯度离心法分离培养骨髓间充质干细胞。②将针对Notch-1的shRNA及无意空质粒shRNA，瞬时转染入骨髓间充质干细胞，转化生长因子β1诱导转染骨髓间充质干细胞分化。③体质量1.0-1.5 kg新西兰兔10只，对兔脊柱L_3-4、L_4-5、L_5-6 3个椎间盘行穿刺抽吸髓核组织造模，将细胞分为转化生长因子β1诱导转染空质粒组、转化生长因子β1诱导转染shRNA-Notch-1质粒组、转化生长因子β1诱导无转染组细胞，于造模2周后分别移植入L_3-4、L_4-5、L_5-6 3个椎间盘。
结果与结论：①细胞移植4周后MRI检测发现，L_3-4(无转染组)及L5-6(空质粒组) %T2加权像扫描(%ST2WI)值有明显增加，L_4-5(shRNA-Notch-1质粒组) %ST2WI值增加最为显著，与其他2组比较差异有显著性意义(P < 0.05)。②甲苯胺蓝染色可见L4-5(shRNA-Notch-1质粒组)椎间盘组织内蛋白多糖的表达显著高于L_3-4(无转染组)及L_5-6(空质粒组)。③RT-PCR和Western blot检测发现L_4-5(shRNA-Notch-1质粒组)椎间盘内Ⅱ型胶原及蛋白多糖的表达明显高于L_3-4(无转染组)及L_5-6(空质粒组)，差异有显著性意义。结果提示兔退变椎间盘内移植Notch-1基因敲除兔骨髓间充质干细胞，有效修复了退变的椎间盘组织。

关键词: 骨髓, 间质干细胞, 基因敲除技术, 椎间盘退化

Abstract:

BACKGROUND: Preliminary experiments have demonstrated that the expression of Notch-1 in the degenerated intervertebral disc was increased. However, the role of Notch-1 in the nucleus pulposus-like cell differentiation of mesenchymal stem cells remains unclear.
OBJECTIVE: To investigate the bone marrow mesenchymal stem cells in suppressing the degeneration of intervertebral discs after Notch1 gene knockout.
METHODS: (1) Bone marrow mesenchymal stem cells were isolated from the femur bone of four New Zealand rabbits weighing 0.4-0.5 kg, under deep anesthesia, and then purified with discontinuous gradient density centrifugation method. (2) Notch1 shRNAs and blank plasmid shRNA were designed, synthesized, and transiently transfected into these mesenchymal stem cells, and the differentiation of mesenchymal stem cells was induced with transforming growth factor beta-1. (3) Ten New Zealand rabbits weighing 1.0-1.5 kg were involved in this study. The rabbits’ intervertebral discs in L_3-4, L_4-5 and L_5-6 were stabbed by a needle, and nucleus pulposus tissue was harvested for modeling. The cells were divided into blank plasmid transfected with transforming growth factor beta-1 group, shRNA-Notch-1 plasmid transfected with transforming growth factor beta-1 group, and non-transfected treated with transforming growth factor beta-1 group. Two weeks later the treated cells were transplanted into L_3-4, L_4-5 and L_5-6, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Four weeks after the cell transplantation, the signal intensity of T2 weighted images in the L_3-4 (non-transfection group) and L_5-6 (blank plasmid group) discs was increased by magnetic resonance imaging, and the significant difference was found in L_4-5 discs (shRNA-Notch-1 plasmid group) in comparison with other two groups (P < 0.05). (2) Toluidine blue staining showed that, the expression of proteoglycan in the L_4-5 discs (shRNA-Notch-1 plasmid group) was significantly higher than that in L_3-4 (non-transfection group) and L_5-6 (blank plasmid group) discs. (3) Reverse transcription-polymerase chain reaction and western blot assay showed that, the expression of collagen II and proteoglycan mRNA and protein in the L_4-5 discs (shRNA-Notch-1 plasmid group) were significantly increased compared with L_3-4 (non-transfection group) and L_5-6 (blank plasmid group) discs. Transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells of Notch-1 gene knockout rabbits can effective restore the degenerated intervertebral discs.

Key words: bone marrow, mesenchymal stem cells, gene knockout techniques, intervertebral disk degeneration

中图分类号:

R394.2

莫日格乐，邵增务. Notch-1基因敲除兔骨髓间充质干细胞可阻止椎间盘退行性变吗？[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(36): 6403-6408.

Mori Gele, Shao Zeng-wu. Restraining degeneration of intervertebral discs by transplantation of Notch-1knockout rabbit bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(36): 6403-6408.

图/表（结果） 5

2.1 实验动物数量分析 14只新西兰兔参加实验，均进入结果分析，中途无脱落。

2.2 各组动物造模前、造模后2周及细胞移植后4周行腰椎矢状位T2加权像核磁共振扫描结果 动物造模2周后MRI检测发现各节段实验椎间盘组织%ST2WI值同术前相比较明显下降，且各组之间差异无显著性意义。细胞移植后4周MRI检测发现：L₃_-₄(无转染组)及L₅_-₆(空质粒组)%ST2WI值有较明显增加；L₄_-₅(shRNA-Notch-1质粒组) %ST2WI值与造模2周时相比增加到了(2.26±1.21)倍，其%ST2WI值增加最为显著，与其他2组比较差异有显著性意义；L₃_-₄、L₅_-₆两组间差异无显著性意义，见图1和表1。

2.3 细胞移植后4周L₃_-₄、L₄_-₅、L₅_-₆椎间盘组织甲苯胺蓝染色结果 在无转染组(L₃_-₄)及空质粒组(L₅_-₆)中，细胞外基质网状分布于髓核内，而软骨样细胞散在分布。shRNA-Notch-1质粒组(L₄_-₅)中髓核内细胞外基质密集分布，散在分布软骨样细胞，可见部分浓聚的细胞外基质，染色明显加深，见图2。

2.4 细胞移植后4周RT-PCR检测L₃_-₄、L₄_-₅、L₅_-₆椎间盘组织相关基因表达 shRNA-Notch-1质粒组(L₄_-₅)的Ⅱ型胶原表达是无转染组(L₃_-₄)的2.51倍，差异有显著性意义(P < 0.001)；是空质粒组(L₅_-₆)的3.13倍，差异有显著性意义(P < 0.001)。shRNA-Notch-1质粒组(L₄_-5)的蛋白多糖表达是无转染组(L₃_-4)的2.13倍，差异有显著性意义(P < 0.01)；是空质粒组(L₅_-6)的2.73倍，差异有显著性意义(P < 0.01)。而无转染组(L₃_-4)与空质粒组(L₅_-6)之间Ⅱ型胶原、蛋白多糖基因表达差异均无显著性意义(P > 0.05)，见图3。

2.5 细胞移植后4周Western-blot检测各组椎间盘组织相关蛋白的表达 shRNA-Notch-1质粒组(L₄_-5)的Ⅱ型胶原蛋白表达是无转染组的1.25倍，差异有显著性意义(P < 0.001)；是空质粒组(L₅_-6)的1.37倍，差异有显著性意义(P < 0.001)。shRNA-Notch-1质粒组(L₄_-5)的蛋白多糖表达是无转染组(L₃_-4)的1.99倍，差异有显著性意义 (P < 0.01)；是空质粒组(L₅_-6)的1.46倍，差异有显著性意义(P < 0.01)。而无转染组(L₃_-4)与空质粒组(L₅_-6)之间Ⅱ型胶原、蛋白多糖蛋白表达差异均无显著性意义(P > 0.05)，见图4。

参考文献

[1] Kalson NS, Richardson S, Hoyland JA. Strategies for regeneration of the intervertebral disc. Regen Med. 2008;3(5): 717-729.
[2] Ruan D, He Q, Ding Y,et al. Intervertebral disc transplantation in the treatment of degenerative spine disease: a preliminary study. Lancet. 2007;369(9566):993-999.
[3] 肖剑,贾连顺,程岚,等.兔腰椎间盘髓核细胞活力测定及外源性基因在其中的表达[J].中国临床康复,2002,6(20):3023-3024.
[4] Erwin WM, Ashman K, O'Donnel P,et al. Nucleus pulposus notochord cells secrete connective tissue growth factor and up-regulate proteoglycan expression by intervertebral disc chondrocytes. Arthritis Rheum. 2006;54(12):3859-3867.
[5] 胡资兵,曾荣,郭伟韬,等.骨髓间充质干细胞诱导分化特征[J].中国组织工程研究与临床康复, 2008,12(43):8561-8566.
[6] Baksh D, Song L, Tuan RS. Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy.J Cell Mol Med. 2004;8(3):301-316.
[7] Indrawattana N, Chen G, Tadokoro M,et al. Growth factor combination for chondrogenic induction from human mesenchymal stem cell. Biochem Biophys Res Commun. 2004;320(3):914-919.
[8] Schwanbeck R, Schroeder T, Henning K,et al. Notch signaling in embryonic and adult myelopoiesis.Cells Tissues Organs. 2008;188(1-2):91-102.
[9] Hayes AJ, Dowthwaite GP, Webster SV,et al.The distribution of Notch receptors and their ligands during articular cartilage development. J Anat. 2003;202(6):495-502.
[10] Andersson ER, Sandberg R, Lendahl U. Notch signaling: simplicity in design, versatility in function. Development. 2011; 138(17):3593-3612.
[11] Wu L, Sun T, Kobayashi K, et al. Identification of a family of mastermind-like transcriptional coactivators for mammalian notch receptors.Mol Cell Biol. 2002;22(21):7688-7700.
[12] Iso T, Kedes L, Hamamori Y. HES and HERP families: multiple effectors of the Notch signaling pathway.J Cell Physiol. 2003;194(3):237-255.
[13] Hiyama A, Skubutyte R, Markova D,et al.Hypoxia activates the notch signaling pathway in cells of the intervertebral disc: implications in degenerative disc disease. Arthritis Rheum. 2011;63(5):1355-1364. .
[14] Colombini A, Lombardi G, Corsi MM,et al. Pathophysiology of the human intervertebral disc. Int J Biochem Cell Biol. 2008; 40(5):837-842.
[15] Risbud MV, Albert TJ, Guttapalli A,et al. Differentiation of mesenchymal stem cells towards a nucleus pulposus-like phenotype in vitro: implications for cell-based transplantation therapy. Spine (Phila Pa 1976). 2004;29(23): 2627-2632.
[16] Bertolo A, Mehr M, Aebli N,et al. Influence of different commercial scaffolds on the in vitro differentiation of human mesenchymal stem cells to nucleus pulposus-like cells. Eur Spine J. 2012;21 Suppl 6:S826-838.
[17] Richardson SM, Curran JM, Chen R,et al.The differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into chondrocyte-like cells on poly-L-lactic acid (PLLA) scaffolds. Biomaterials. 2006;27(22):4069-4078.
[18] Sakai D, Mochida J, Yamamoto Y,et al. Transplantation of mesenchymal stem cells embedded in Atelocollagen gel to the intervertebral disc: a potential therapeutic model for disc degeneration. Biomaterials. 2003;24(20):3531-3541.
[19] Acosta FL Jr, Metz L, Adkisson HD,et al. Porcine intervertebral disc repair using allogeneic juvenile articular chondrocytes or mesenchymal stem cells.Tissue Eng Part A. 2011;17(23-24):3045-3055.
[20] 王佳,陈晓禾,黄永灿,等.缺氧对hBMSCs和胎盘来源MSCs增殖的影响[J].中国修复重建外科杂志,2009, 23(2):136-139.
[21] Wuertz K, Godburn K, Neidlinger-Wilke C,et al. Behavior of mesenchymal stem cells in the chemical microenvironment of the intervertebral disc.Spine (Phila Pa 1976). 2008;33(17): 1843-1849.
[22] Moore KA, Lemischka IR.Stem cells and their niches.Science. 2006;311(5769):1880-1885.
[23] Wuertz K, Godburn K, Neidlinger-Wilke C,et al.Behavior of mesenchymal stem cells in the chemical microenvironment of the intervertebral disc.Spine (Phila Pa 1976). 2008;33(17): 1843-1849.
[24] Sulkowski S, Wincewicz A, Sulkowska M,et al.Transforming growth factor-beta1 and regulators of apoptosis. Ann N Y Acad Sci. 2009;1171:116-123.
[25] Bosnakovski D, Mizuno M, Kim G, et al. Chondrogenic differentiation of bovine bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) in different hydrogels: influence of collagen type II extracellular matrix on MSC chondrogenesis.Biotechnol Bioeng. 2006;93(6):1152-1163.
[26] Steck E, Bertram H, Abel R,et al. Induction of intervertebral disc-like cells from adult mesenchymal stem cells.Stem Cells. 2005;23(3):403-411.

引言

椎间盘退行性病变引起的颈肩腰腿痛是临床最常见的疾病之一，其主要病理变化为髓核组织中Ⅱ型胶原和蛋白多糖含量减少。有学者曾经将自体类软骨细胞移植到椎间盘内后发现椎间盘髓核内的细胞外基质明显增多^[1-2]。但是由于髓核来源的细胞体外培养增殖时间长，细胞数量少且不容易获得，故作为组织工程的种子细胞有一定限制^[3]。近年来治疗性克隆(therapeutic cloning)概念的提出为许多疾病的治疗指明了研究方向。骨髓间充质干细胞具有增殖能力强、多向分化潜能、自我更新能力等特点一直是组织工程研究的热点。其在特定条件下可以向成骨细胞、软骨细胞、血管内皮细胞及星形胶质细胞转化，是组织工程中重要的种子细胞^[4-6]，并且已被证实在体外转化生长因子β1诱导条件下可以向成软骨细胞转化^[7]。利用组织工程学原理和方法将骨髓间充质干细胞与特定定向分化诱导剂复合植入椎间盘内，渴望再新生工程化的髓核细胞，从而为椎间盘的退变和治疗提供了一条新途径。

Notch基因广泛存在于脊椎动物中，在进化上具有高度的保守性，是一种跨膜蛋白，当其与配体结合后，早老素1参与的酶复合体切割Notch蛋白，产生Notch细胞内结构域并转移至核内^[8]。研究表明，相邻细胞可以通过Notch受体与配体的结合传递Notch信号，从而扩大并固化细胞间的分子差异，最终决定细胞命运，影响器官形成和形态发生^[9-10]。在哺乳动物中，Notch信号转导通路有4种受体(Notch-1、2、3、4)和5种配体(Jagged1、2，Delta 1、3、4)^[11]。这些配体和受体都是单跨膜蛋白，需要细胞之间的相互接触才能激活。最近一项研究表明大鼠椎间盘内髓核细胞表达Notch-1，其配体Jagged1 及下游分子DTX1^[12]，并且在大鼠退变椎间盘内发现Notch-1呈高表达^[13]。

因此，实验拟通过RNAi基因沉默技术，以针对Notch-1的shRNA表达载体转染兔骨髓间充质干细胞，旨在实现对骨髓间充质干细胞中Notch-1表达进行抑制，并通过转化生长因子β1诱导后移植入兔退变椎间盘，观测Notch-1基因敲除后的骨髓间充质干细胞修复退变椎间盘的作用。

材料方法

设计：细胞移植动物体内对比观察实验。

时间及地点：实验于2011年9月至2012年9月在华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科实验室完成。

材料：

实验动物：1月龄新西兰兔4只，体质量0.4-0.5 kg；体质量1.0-1.5 kg新西兰兔10只，3月龄，购于华中科技大学同济医学院实验动物中心。

主要试剂和仪器：DMEM-HAM-S/F12(DF)培养基、胎牛血清(GIBCO)，淋巴细胞分离液(上海索莱宝生物科技有限公司)，0.25%胰酶(武汉博士德生物科技)，抗Ⅱ型胶原抗体、抗蛋白多糖抗体(Abcam)，转化生长因子β1(PeproTech)，Lipofectamin、Trizol Reagent (Invitrogen Life Technologies)，RT-PCR试剂盒(TOYOBO)，Western blotting试剂盒(Beyotime Institute of Biotechnology)，1.5T超导型磁共振扫描仪(Siemens)。

实验方法：

纤维环穿刺抽吸法制备兔椎间盘退变模型：10只体质量1.0-1.5 kg新西兰兔，以水合氯醛(3%，1 mL/kg)麻醉，术中头孢孟多酯钠0.5 g耳缘静脉静滴，取右侧卧位，术区备皮后1%活力碘消毒，铺无菌巾，取腹部外侧入路，做8 cm左右切口，沿神经平面分离至椎体，暴露L₃_-₄、L₄_-₅、L₅_-₆椎间隙，穿刺点选为各个椎间隙中点，5 mL注射器连接18号针头垂直于纤维环刺入约5 mm，回抽注射器，感觉到针芯明显有回弹时拔出针头推出胶冻状组织，即为髓核组织。关闭伤口后无菌纱布敷料包扎固定。术后每日肌注头孢孟多酯钠0.25 g，每2 d伤口换药。术后2周行MRI检查确定椎间盘退变情况。

骨髓间充质干细胞分离培养：4只体质量0.4-0.5 kg新西兰兔，以水合氯醛(3%，1 mL/kg)麻醉，术区备皮，于股骨大转子处将18号骨穿针刺入股骨髓腔，肝素化注射器抽取骨髓，迅速移至超净台后置于2 mL DMEM/F12培养液内，吹打混匀，沿管壁缓慢注入4 mL淋巴细胞分离液上层，1 500 r/min(离心半径16.1 cm)离心25 min，吸取中间云雾状层面，PBS洗涤3次后以1×10⁹ L^-¹细胞浓度接种于含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，置于体积分数为5%CO₂、37 ℃培养箱。每3 d换液，倒置显微镜观察生长情况，取第3代细胞用于以下实验。

shRNA-Notch-1转染骨髓间充质干细胞：siRNA合成与shRNA-Notch-1质粒构建由上海吉玛制药技术有限公司完成。将细胞分为空质粒、shRNA-Notch-1转染及无转染3组。①转染前1 d，以5×10⁷ L^-¹的浓度将第3代骨髓间充质干细胞接种在6孔板上，加入3 mL含体积分数为5%胎牛血清的DMEM细胞培养基，置于37 ℃、体积分数为5% CO₂培养箱中，培养至细胞汇合达到70%-90%。②取3组50 μL的Opti-MEM无血清培养基，其中两组中分别加入1 μg shRNA-Notch-1质粒及空质粒pYr1.1，柔和混匀。③取3组3 μL Lipofectamin试剂，分别加入混匀的50 μL无血清的Opti-MEM中，轻轻混匀，室温放置5 min后分别与步骤②所得3组溶液混合，轻柔混匀，室温放置20 min，以便形成质粒/Lipofectamin复合物。④将3组100 μL质粒/Lipofectamin复合物分别加到含有细胞培养基的培养板孔中，来回轻柔摇晃细胞培养板。⑤细胞在CO₂培养箱中37 ℃温育，每3 d换液1次，倒置显微镜观察细胞生长情况。

转化生长因子β1诱导shRNA-Notch-1转染骨髓间充质干细胞：完全培养基(含有体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养液)加地塞米松(10^-⁸ mol/L)，转化生长因子β1 (10 μg/L)，维生素C(10 mmol/L)制备成为诱导条件培养基。取长势良好的各组细胞(A组：空质粒组，B组：shRNA-Notch-1质粒组，C组：无转染组)，调整细胞浓度为1×10⁹L^-¹后接种于含转化生长因子β1的条件培养基中，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱培养备用。

细胞移植：0.25%胰酶消化悬浮各组细胞，1 000 r/min离心后调整细胞浓度为10¹⁰ L^-¹。取造模后2周的新西兰兔，以水合氯醛(3%，1 mL/kg)麻醉，术中使用头孢孟多酯钠0.5 g静滴，备皮，术野消毒铺巾，取原切口，沿肌肉间隙分离至椎体前方，可见造模后各个椎间盘于穿刺点处瘢痕隆起。暴露L₃_-₄、L₄_-₅、L₅_-₆椎间隙，1 mL注射器吸取无转染组、shRNA-Notch-1质粒组、空质粒组细胞100 μL，穿刺点选为L₃_-₄、L₄_-₅、L₅_-₆椎间隙中点，垂直于纤维环刺入约5 mm后注入细胞悬液，术毕，关闭伤口后消毒，无菌纱布敷料包扎固定。术后每日肌注头孢孟多酯钠0.25 g，每2 d伤口换药。术后4周进行相关检测。

核磁共振成像扫描：在动物造模前、造模后2周及细胞移植后4周均行腰椎矢状位T2加权像核磁共振扫描(TR/TE：3 500 ms/120 ms，层厚：3 mm，层间距：1 mm)，测量各个实验椎间隙高度及椎间盘内T2值，比较造模前后及治疗前后的数值变化。

甲苯胺蓝染色：细胞移植4周后，耳缘静脉空气栓塞处死动物，手术切取腰段脊柱，切取L₃_-₄、L₄_-₅、L₅_-₆椎间盘组织，体积分数为4%甲醛固定，乙醇脱水、二甲苯透明，包埋机石蜡包埋，切片机5 mm切片。脱蜡至水后1%盐酸乙醇分色45 s，水洗后氨水促蓝，水洗至无氨味后甲苯胺蓝染色8 min，蒸馏水洗除染料，体积分数为95%乙醇分色30 s，体积分数为100%乙醇脱水 3 min、二甲苯透明10 min×2、加拿大树胶封固，光镜下观察。

RT-PCR检测相关基因表达：裂解液裂解组织后按照RT-PCR试剂盒说明进行，反转录后PCR引物如下：Ⅱ型胶原：上游引物：5’-CCT GTG CGA CGA CAT AAT CTG T-3’，下游引物：5’-GGT CCT TTA GGT CCT ACG ATA TCC T-3’；蛋白聚糖：上游引物：5’-TCC ACC ATT CGG CAT AAC TG-3’，下游引物：5’-TCC ACA GAC CCT AAG CCT TCT T-3´；GADPH(内标)：5’-CGC CTG GAG AAA GCT GCT A-3’，下游引物：5’-ACG ACC TGG TCC TCG GTG TA-3’。按如下条件扩增：94 ℃预变性5 min后，94 ℃变性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循环35次再72 ℃延伸7 min。取扩增产物5 μL与上样缓冲液混合进行2%琼脂糖凝胶电泳。采用英国UVP公司GDS8000型全自动图像分析系统对扩增产物条带的吸光度值进行分析。

Western-blot检测相关蛋白的表达：细胞移植4周后，耳缘静脉空气栓塞处死动物，手术切取腰段脊柱，切取L₃_-₄、L₄_-₅、L₅_-₆椎间盘组织，裂解液裂解组织后进行蛋白质定量，沸水浴加热3 min，SDS-PAGE凝胶电泳，PVDF转膜后5%脱脂牛奶封闭2 h，加入一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3×10 min，加入二抗室温孵育2 h，TBST洗膜3×10 min后发光显色剂激发显色，拍照后进行图像分析。结果以蛋白条带吸光度值比值表示。

主要观察指标：①核磁共振成像扫描观察各节段实验椎间盘组织%ST2WI值。②甲苯胺蓝染色观察细胞外基质及软骨样细胞分布情况。③RT-PCR检测Ⅱ型胶原与蛋白多糖基因表达。④Western-blot检测Ⅱ型胶原与蛋白多糖蛋白表达。

统计学分析：实验数据以x(_)±s表示，采用SPSS 13.0作统计学处理，组间数据处理采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

椎间盘退行性病变引起的颈肩腰腿痛是临床最常见的疾病之一，其发生、发展的过程是缓慢而又复杂的，其主要病理变化表现为髓核组织中细胞外基质Ⅰ、Ⅲ型胶原增加与Ⅱ型胶原和蛋白聚糖含量减少，进而逐渐导致椎间盘组织含水量降低，椎间盘功能退化、丧失^[14]。近年来利用干细胞移植技术治疗椎间盘退变逐渐成为研究的热点。Risbud等^[15]在转化生长因子β1的诱导下，首先在体外成功的将骨髓间充质干细胞诱导分化为髓核样细胞，为椎间盘退变的治疗开拓了新思路。Bertolo等^[16]将两种不同的生物材料支架分别与骨髓间充质干细胞三维共培养5周后检测，发现Ⅱ型胶原及蛋白多糖显著表达。另有学者发现用生物材料进行骨髓间充质干细胞的三维培养可以诱导其向类软骨细胞分化^[17-18]。Acosta等^[19]在猪退变椎间盘内移植骨髓间充质干细胞，分别于3，6，12个月后观察发现椎间盘组织Ⅱ型胶原表达持续增高。这些研究结果表明骨髓间充质干细胞在特定的条件下可向成软骨细胞分化，而髓核细胞已被证实为类软骨细胞。但是目前将骨髓间充质干细胞移植入椎间盘内仍有许多问题有待解决，如怎样使骨髓间充质干细胞在椎间盘内低氧、高渗、偏酸、低糖的微环境中的存活率提高等^[20-23]。

目前对各种细胞因子的发现为诱导干预特定细胞的生物学功能提供了契机。转化生长因子β1作为较早发现的细胞因子，已经有了长足的深入研究。Sulkowski 等^[24]在研究中证实不同浓度的转化生长因子β1能促进多种细胞表达不同的基质蛋白，刺激胶原沉积，提高纤维蛋白酶原分泌，促进血管生成等。而转化生长因子β1可诱导骨髓间充质干细胞向髓核样细胞分化已被广泛证实^[25-26]。作者实验中以转化生长因子β1诱导骨髓间充质干细胞定向分化，成功得到具有特定表型的髓核样细胞。

实验中通过RNA干扰技术成功对骨髓间充质干细胞中Notch-1表达进行抑制，并通过转化生长因子β1诱导使骨髓间充质干细胞定向分化后移植入兔退变椎间盘内，观察对退变椎间盘的修复作用。实验结果显示，影像学上直观可见退变椎间盘得到有效修复；组织学甲苯胺蓝染色shRNA-Notch-1质粒组染色阳性表达明显高于无转染组和空质粒组；相关基因检测方面RT-PCR及Western blot结果显示shRNA-Notch-1质粒组Ⅱ型胶原及蛋白多糖表达均明显高于无转染组和空质粒组。这些结果表明，Notch-1基因可能在骨髓间充质干细胞向髓核样细胞转化中起到抑制作用，抑制Notch-1基因的表达可有效提高转化后的髓核样细胞表达细胞外基质Ⅱ型胶原及蛋白多糖，使髓核样细胞更趋于年轻化，从而可以利用组织工程学原理和方法将Notch-1基因沉默的骨髓间充质干细胞与特定定向分化诱导剂复合植入椎间

盘内，渴望再新生工程化的髓核细胞，为椎间盘退变的治疗提供了一条新途径。同时也可以推测，椎间盘组织内髓核细胞的生成、增殖及其活性同样受到Notch-1基因的调控，通过对Notch-1基因表达的抑制，可以使椎间盘内髓核细胞的生物活性得到提高，从而可以延缓椎间盘组织的衰老进程，为预防椎间盘退变提供了一种可能。

Notch-1基因敲除兔骨髓间充质干细胞可阻止椎间盘退行性变吗？

Restraining degeneration of intervertebral discs by transplantation of Notch-1knockout rabbit bone marrow mesenchymal stem cells

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[1]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.
[2]	梁学奇, 郭黎姣, 陈贺捷, 武杰, 孙雅琪, 邢稚坤, 邹海亮, 陈雪玲, 吴向未. 泡状棘球绦虫原头蚴抑制骨髓间充质干细胞向成纤维细胞的分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 996-1001.
[3]	耿瑶, 尹志良, 李兴平, 肖东琴, 侯伟光. hsa-miRNA-223-3p调控人骨髓间充质干细胞成骨分化的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1008-1013.
[4]	伦志刚, 金晶, 王添艳, 李爱民. 过氧化物还原酶6干预骨髓间充质干细胞增殖及体外向神经谱系诱导分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1014-1018.
[5]	朱雪芬, 黄成, 丁健, 戴永平, 刘元兵, 乐礼祥, 王亮亮, 杨建东. 胶质细胞神经营养因子诱导骨髓间充质干细胞向功能性神经元分化的机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1019-1025.
[6]	裴丽丽, 孙贵才, 王弟. 丹酚酸B抑制骨髓间充质干细胞氧化损伤及促进分化为心肌样细胞[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1032-1036.
[7]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[8]	化昊天, 赵文宇, 张磊, 白文博, 王新卫. 抗生素人工骨治疗慢性骨髓炎疗效和安全性的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(6): 970-976.
[9]	陈俊毅, 王宁, 彭称飞, 朱伦井, 段江涛, 王烨, 贝朝涌. 脱钙骨基质与慢病毒介导沉默P75神经营养因子受体转染骨髓间充质干细胞构建组织工程骨[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 510-515.
[10]	李兴平, 肖东琴, 赵桥, 陈硕, 白亦光, 刘康, 冯刚, 段可. 钛表面载铜抗菌功能膜的制备及性能[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 553-557.
[11]	刘飞, 崔宇韬, 刘贺. 局部抗生素递送系统治疗骨髓炎的优势与问题[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 614-620.
[12]	姜涛, 马磊, 李志强, 寿玺, 段明军, 吴硕, 马创, 魏琴. 血小板衍生生长因子BB诱导骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3937-3942.
[13]	孙建威, 杨新明, 张瑛. 孟鲁司特联合骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤模型大鼠[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3962-3969.
[14]	张立书, 刘安琪, 何小宁, 金岩, 李蓓, 金钫. Alpl基因影响骨髓间充质干细胞治疗溃疡性结肠炎[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3970-3975.
[15]	郝晓娜, 张英杰, 李玉云, 许涛. 过表达脯氨酰寡肽酶的骨髓间充质干细胞修复肝纤维化模型大鼠[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3988-3993.